多酚氧化酶（PPO）活性檢測試劑盒說明書

可見分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC0190
規格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液：臨用前將粉劑一倒入提取液中，溶液為懸濁液，使用前需搖勻。

產品簡介：
PPO主要存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是一種含銅的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化產生醌，從而引起褐化，與果蔬加工、茶葉品質和組培等密切相關。
PPO能夠催化鄰苯二酚產生鄰苯二醌，后者在410nm有特征光吸收。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照每500萬細菌或細胞加入1mL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率200W，超聲3秒，間隔10秒，重復30次）；8000g 4℃離心10分鐘，取上清，置冰上待測。

2. 稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10分鐘，取上清，置冰上待測。

3. 血清（漿）：直接檢測。若有渾濁請離心后去上清使用。

二、測定步驟

1. 分光光度計預熱30min以上，調節波長至410nm，蒸餾水調零。

2. 樣本測定（在EP管中依次加入下列試劑）

37℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）中準確水浴10min后，迅速放入沸水中加熱10min。冷卻后，5000g，常溫離心10min，收集上清，410nm處檢測測定管和對照管吸光度，計算ΔA=A測定-A對照。
注意：每個測定管需要設置一個對照管，可以在不同對照管中加入不同樣本的粗酶液，然后集中進行5min沸水浴處理。
三、PPO活性計算
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應體系中使410nm處吸光值變化0.01定義為一個酶活力單位。
PPO活性（U/mg prot）= ΔA÷0.01×V反總÷（Cpr×V樣）÷T =60×ΔA÷Cpr
（2）按樣本質量計算：
單位的定義：每分鐘每g組織在每mL反應體系中使410nm處吸光值變化0.01定義為一個酶活力單位。
PPO活性（U/g 質量）=ΔA÷0.01×V反總÷（W÷V樣總×V樣）÷T =60×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞數量計算：
單位的定義：每分鐘每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中使410nm處吸光值變化0.01定義為一個酶活力單位。
PPO活性（U/10⁴ cell）= ΔA÷0.01×V反總÷（500÷V樣總×V樣）÷T =0.12×ΔA
V反總：反應體系總體積，0.9mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.15mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞數量，500萬；T：反應時間，10min。
注意事項：
不同樣本的多酚氧化酶最佳的反應溫度略有差別，可在25-37℃之間進行調節。
相關發表文獻：

1. Li B, Ding Y, Tang X, et al. Effect of L-Arginine on Maintaining Storage Quality of the White Button Mushroom (Agaricus bisporus)[J]. Food and Bioprocess Technology, 2019, 12(4): 563-574.

2. B Li,Y Ding, X Tang,et al. MTA1 promotes the invasion and migration of pancreatic cancer cells potentially through the HIF-α/VEGF pathway. Journal of Receptor and Signal Transduction Research. August 2018;(IF2.998)

參考文獻：

1. González, Eva M, De Ancos B , Cano M P . Partial Characterization of Polyphenol Oxidase Activity in Raspberry Fruits[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47(10):4068-4072.

2. Hong‐Wei Zhou, Feng X . Polyphenol oxidase from yali pear (Pyrus bretschneideri)[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 1991, 57(3):307-313.

3. Tang W, Newton R J . Increase of polyphenol oxidase and decrease of polyamines correlate with tissue browning in Virginia pine (Pinus virginiana Mill.)[J]. plant science, 2004, 167(3):621-628.

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